产品货号：
WH0173
中文名称：
超高保真PCR预混液
英文名称：
2×HiFi PCR Mix
产品规格：
1ml|5ml
发货周期：
1～3天
产品价格：
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超高保真PCR预混液是一种新型高保真PCR扩增预混反应液，适用于高通量测序文库的PCR扩增和其他PCR相关的克隆和检测。
本制品为一管式PCR预混液形式，内含热启动DNA聚合酶、超纯dNTPs、MgCl2、反应缓冲液等PCR反应所需组分，只需加入模板和引物即可进行PCR扩增反应，操作简便。除此之外，该PCR预混液中还整合了PCR反应增强系统，不但提高了PCR预混液的稳定性，使得聚合酶对PCR反应抑制剂的耐受能力增强，还提高了DNA聚合酶对不同GC含量模板的适应能力，使得本制品具有广泛的样品普适性和模板投入范围，将PCR反应的偏好性降至最低。
2×HiFi PCR Mix中的Ultra HiFi DNA聚合酶是通过定向分子进化技术开发得到的新型快速高保真DNA聚合酶，增强了DNA聚合酶对模板的亲和力，使得此酶在扩增速度和延伸能力上得到了提升，增加了PCR成功率和产物量。同时，此酶具有优良的3'- 5'外切酶活性，保真性可达市场上主流产品水平，保证了基因和文库扩增过程中的真实性。此外，本制品中的DNA聚合酶具有热启动功能，可有效的控制低温情况下的非特异扩增和酶活损耗，进而保证了PCR扩增的特异性和稳定性。
本制品的PCR产物为平末端，可加A处理再与T载体连接或直接使用平末端克隆载体进行基因克隆，如我公司的零背景快速克隆试剂盒。
- 扩增快速：延伸速度可达10～15sec/kb；
- 延伸力强：可扩增长至15kb的DNA片段；
- 特异性好：具有热启动功能，可用于多重PCR；
- 灵敏度高：模板用量可低至10pg；
- 偏好性低：针对不同GC含量的模板都有均衡的扩增效果；
- 应用广泛：可用于高通量测序文库的PCR扩增和其他PCR相关的克隆和检测。
- 用于DNA的高保真快速扩增，如基因表达克隆、基因定点突变、基因组点突变的分析（SNP）等；
- 更可用于高通量测序中，如高保真基因组DNA文库的富集。
| 组分 | 1mL | 5mL |
| 2×HiFi PCR Mix | 1mL | 5×1mL |
| Nuclease-Free Water | 1mL | 5×1mL |
保存：-20℃，避免反复冻融，有效期1年。
一、高通量测序文库的PCR扩增
- 将2×HiFi PCR Mix、P5/P7 Primers（客户自备）和ddH2O于室温条件下（15～25℃）融化，混匀，简短离心后于冰盒上备用。
- 按照下表体系进行PCR反应体系的配制（50μL体系）：
成分 使用量 反应浓度 2×HiFi PCR Mix 25μL 1× P5 Primer（10μM) 5μL 1μM P7 Primer（10μM) 5μL 1μM 纯化过的接头连接产物 Variable ＜1μg Nuclease-Free ddH2O 至50μL - - 配制反应体系时，请全程将反应管置于冰上进行操作。对于多个样品，请计算所需试剂的总体积并在此基础上额外添加10%，以避免分装过程中枪头挂壁损失而导致试剂体积不足。
- 按下表设置PCR仪反应程序，开启热盖，温度设置于105℃。
步骤 温度 时间 循环数 1 98℃ 2min 1 2 98℃ 20sec 6～12 3 60℃ 30sec 4 72℃ 30sec 5 72℃ 1min 1 6 4℃ Hold 1 - 请根据DNA的质量和上样量确定PCR循环数。一般而言，对于100ng、10ng、1ng文库起始DNA，在进行PCR富集时分别需要扩增6、10、12个循环。如果在PCR富集之前经过片段大小筛选步骤（size-selection），则建议在原有基础上再增加2～4个循环；如果DNA质量较差（比如提取于FFPE样品），则建议在原有基础上再增加1～3个循环。
- PCR样品温度降至4℃后，可将PCR产物取出并纯化回收。纯化过程可参考NGS文库富集试剂相关步骤。
- 上机测序前可使用凝胶电泳、qPCR定量或者Agilent生物分析仪对DNA文库质量进行鉴定。纯化后得到的DNA文库可保存于-20℃。
二、常规PCR扩增
- PCR反应液的配制：
- 将2×HiFi PCR PreMix、引物、模板和ddH2O于室温条件下融化，混匀，简短离心后于冰盒上备用。
- 按照下表体系进行PCR反应体系的配制：（50μL反应体系）
成分 用量 终浓度 DNA模板 Variable - Primer F（10μM) 1.25μL 0.25μM Primer R（10μM) 1.25μL 0.25μM 2×HiFi PCR Mix 25μL 1× Nuclease-Free ddH2O 至50μL - - 配制反应体系时，请全程将反应管置于冰上进行操作。对于多个样品，请计算所需试剂的总体积并在此基础上额外添加10%，以避免分装过程中枪头挂壁损失而导致试剂体积不足。
- 引物终浓度为0.25μM时可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；适当减少PCR反应体系中的引物浓度则可以增加PCR反应特异性。如有必要，可以在0.2～1.0μM间进行优化选择。
- 模板DNA用量请参照如下表（50μL PCR反应体系）
模板类型 模板用量范围 推荐模板用量 基因组DNA 1～1000ng 100～500ng 质粒DNA 0.01～100ng 1～10ng cDNA 1～200ng 50～100ng λDNA 0.01～100ng 1～10ng
- 配制反应体系时，请全程将反应管置于冰上进行操作。对于多个样品，请计算所需试剂的总体积并在此基础上额外添加10%，以避免分装过程中枪头挂壁损失而导致试剂体积不足。
- 按步骤2中建议模板及引物用量加入模板、引物和ddH2O，混匀后上机进行PCR反应。
- 将2×HiFi PCR PreMix、引物、模板和ddH2O于室温条件下融化，混匀，简短离心后于冰盒上备用。
- PCR反应条件：
- 使用2×HiFi PCR Mix进行扩增反应时，请先使用三步法。
- 进行三步法扩增时，按延伸速度按照10～15sec/kb进行设定。对于DNA长度≥10kb的模板或复杂模板，可将延伸时间延长至30sec/kb。下述反应程序仅供参考，实际情况下，客户可按照自身情况进行更改和调整。
步骤 温度 时间 循环数 1 94℃ 2min 1 2 98℃ 10sec 35 3 60℃ 30sec 4 68℃ 10～15sec/kb 5 68℃ 5min 1 6 4℃ Hold 1 - 退火温度为60℃可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。PCR反应特异性不高时，可以在55～68℃范围内适当增加退火温度；如果引物Tm值小于63℃，可以将退火温度按Tm值进行设定。
- 当扩增产物出现杂带或弥散时，请尝试两步法或降落PCR（Step down PCR）。
步骤 温度 时间 循环数 1 94℃ 2min 1 2 98℃ 10sec 35 3 68℃ 10～15sec/kb 4 68℃ 5min 1 5 4℃ Hold 1 - 结果检测：反应结束后取5μL反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
- 使用2×HiFi PCR Mix进行扩增反应时，请先使用三步法。
- 扩增模板类型及长片段扩增举例：
- 有记录的样品适用范围和扩增长度如下表所示：
模板类型 有记录的长片段扩增 人基因组DNA -8kb 大鼠基因组DNA -8kb 水稻基因组DNA -8kb 麦基因组DNA -8kb 玉米基因组DNA -8kb 大肠杆菌基因组DNA -8kb cDNA -6kb λDNA -15kb - 具体扩增效果举例：
- 有记录的样品适用范围和扩增长度如下表所示：
- 无扩增产物或扩增产物很少
问题 分析 循环条件不合适 将延伸时间延长至15～30sec/kb 增加2～5个循环 使用Step down PCR（针对8kb以上扩增片段效果明显） 模板DNA在质量或数量上不满足要求 增加模板加入量 减少模板加入量（降低过量模板的抑制作用或者降低不纯净模板中PCR抑制物的干扰) 尽量用经过纯化的模板 模板中RNA要去除干净 引物问题 引物浓度不适合，当扩增片段较长时尽量选择相对较低的引物浓度（0.2～0.3μM)；
当模板浓度较低时，尽量选择相对较高的引物浓度（0.3～0.5μM）尽量使用新配制的引物 引物设计不合理，重新优化引物 - 出现杂带或弥散
问题 分析 循环条件不合适 提升退火温度或尝试两步法 使用Step down PCR 减少2～5个循环 引物降解或设计不合理 重新配制或设计引物（适当的增加引物长度可提高引物和模板间的特异性） 模板过量 按照说明书中推荐模板用量添加
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